Kloniranje genov je dejanje izdelave kopij ali klonov enega samega gena. Ko je gen določen, se kloni lahko uporabljajo na številnih področjih biomedicinskih in industrijskih raziskav. Genetski inženiring je proces kloniranja genov v novih organizmih ali spreminjanja sekvence DNA za spreminjanje beljakovinskega produkta. Genetski inženiring je odvisen od naše sposobnosti za izvajanje naslednjih bistvenih postopkov.
01 Reakcija verižne verige polimeraze
02 omejevalni encimi
Odkritje encimov, znanih kot omejitvene endonukleaze, je bilo bistveno za beljakovinski inženiring . Ti encimi zmanjšajo DNA na določenih lokacijah na podlagi nukleotidnega zaporedja. Na stotine različnih restrikcijskih encimov , ki so sposobne rezati DNK na ločenem mestu, smo izolirali iz številnih različnih sevov bakterij. DNK, rezan z omejevalnim encimom, proizvede veliko manjših fragmentov različnih velikosti. Te lahko ločimo z gelsko elektroforezo ali kromatografijo.
03 Elektroforeza
Čiščenje DNK iz celične kulture ali rezanje z uporabo restrikcijskih encimov ne bi bilo zelo koristno, če ne bi mogli vizualizirati DNK - to je najti način, da vidimo, ali vaš izpis vsebuje kaj ali kakšna velikost vas razdeli Vrezal sem ga. Eden od načinov za to je gelna elektroforeza. Geli se uporabljajo za različne namene, od gledanja rezane DNK do detekcije vložkov DNA in knockouts.
04 Pridružite se dvema deloma DNA
V genetskih raziskavah je pogosto potrebno povezati dve ali več posameznih sklopov DNA, ustvariti rekombinantno verigo ali zapreti krožno verigo, ki je bila prekinjena z restrikcijskimi encimi. Encimi, imenovani DNK ligaze, lahko ustvarjajo kovalentne vezi med nukleotidnimi verigami. Enakimi DNA polimeraza I in polinukleotid kinaza sta prav tako pomembna v tem postopku, da se zapolnita vrzeli ali fosforilirajo 5 'koncev.
05 Izbira majhne samorepekajoče DNK
Majhni krožni deli DNK, ki niso del bakterijskega genoma, vendar so zmožni samoregulacije, so znani kot plazmidi. Plazmidi se pogosto uporabljajo kot vektorji za prenos genov med mikroorganizmi. V biotehnologiji, po tem, ko je bil gen zanimanja ojačen in so geni in plazmidi prekinjeni z restrikcijskimi encimi, se ligirajo skupaj, ki ustvarjajo tisto, kar je znano kot rekombinantna DNA. Virusna (bakteriofagna) DNA se lahko uporablja tudi kot vektor, kot tudi kozmidi, rekombinantni plazmidi, ki vsebujejo bakteriofagne gene.
06 Metoda za premikanje vektorja v gostiteljsko celico
Postopek prenosa genskega materiala na vektor, kot je plazmid, v nove gostiteljske celice, se imenuje transformacija. Ta tehnika zahteva, da so gostiteljske celice izpostavljene spremembi okolja, zaradi česar so "kompetentne" ali začasno prepustne za vektor. Elektroporacija je ena takšna tehnika. Čim večji je plazmid, nižja je učinkovitost, s katero jo prevzamejo celice. Večji segmenti DNA so lažje klonirani z bakteriofagijo, retrovirusom ali drugimi virusnimi vektorji ali kozmidi v postopku, imenovani transdukcija. Fagni ali virusni vektorji se pogosto uporabljajo v regenerativni medicini, vendar lahko povzročijo vstavitev DNK v dele naših kromosomov, kjer to ne želimo, kar povzroča zaplete in celo raka.
07 Metode izbire transgenih organizmov
Vse celice ne bodo prevzele DNK med preoblikovanjem. Bistveno je, da obstaja metoda odkrivanja tistih, ki to počnejo. Na splošno plazmidi nosijo gene za odpornost na antibiotike in transgene celice se lahko izberejo na osnovi ekspresije teh genov in njihove sposobnosti rasti na medijih, ki vsebujejo ta antibiotik. Alternativne metode izbire so odvisne od prisotnosti drugih reporterjevih proteinov, kot je sistem x-gal / lacZ ali zeleni fluorescenčni protein, ki omogočajo izbiro glede na barvo in fluorescenco.