Kaj PCR naredi s sekvenciranjem DNA in ojačevalnimi geni
Polimerazna verižna reakcija ( PCR ) je molekularna genetska tehnika za izdelavo več kopij gena in je tudi del postopka sekveniranja genov.
Kako deluje verižna reakcija s polimerazo?
Kopije genov se izdelujejo z uporabo vzorca DNK, tehnologija pa je dovolj dobra, da naredi več kopij iz ene same kopije gena v vzorcu. PCR ojačanje gena za izdelavo milijonov kopij omogoča odkrivanje in identifikacijo genskih sekvenc z uporabo vizualnih tehnik, ki temeljijo na velikosti in obremenitvi (+ ali -) dela DNA.
V nadzorovanih pogojih majhne segmente DNA nastajajo encimi, znani kot DNK polimeraze, ki doda komplementarne deoksinukleotide (dNTP) na del DNA, ki je znana kot "šablona". Kot izhodišče za polimerazo uporabljamo še manjše dele DNK, imenovane "primerki". Primerji so majhni umetni deli DNA (oligomeri), ponavadi med 15 in 30 nukleotidov. Nastanejo tako, da poznajo ali uganijo kratke sekvence DNA na samih koncih gena, ki se ojačajo. Med PCR se DNA sekvenci segrejejo in dvojne pramene ločijo. Po hlajenju se prašniki vežejo na predlogo (imenovano žarjenje) in ustvarijo prostor za začetek polimeraze.
PCR tehnika
Polimerazno verižno reakcijo (PCR) je omogočila odkritje termofilov in termofilnih polimeraznih encimov (encimi, ki ohranjajo strukturno celovitost in funkcionalnost po segrevanju pri visokih temperaturah).
Koraki v tehniki PCR so naslednji:
- Zmes se ustvari z optimiziranimi koncentracijami vzorca DNA, polimeraznega encima, primerkov in dNTP. Zmožnost segrevanja mešanice brez denaturiranja encima omogoča denaturiranje dvojnega vijaka vzorca DNK pri temperaturah v območju 94 stopinj Celzija.
- Po denaturaciji se vzorec ohladi na bolj zmerno območje, približno 54 stopinj, kar olajša žarjenje (vezava) temeljnih premazov na vzorce enostranske DNA.
- V tretjem koraku cikla se vzorec ponovno segreje na 72 stopinj, idealna temperatura za DNA-polimerazo Taq, za raztezek. V času raztezanja DNA polimeraza uporablja prvotno enojno vrsto DNK kot predlogo za dodajanje komplementarnih dNTP na 3 'konca vsakega primerka in ustvari del dvovalentne DNK v območju zanimanja.
- Primerci, ki so žarili v sekvence DNA, ki niso natančno ujemanje, ne ostanejo žarjeni pri 72 stopinjah, s čimer se omeji raztezanje na gen, ki je zanimiv.
Ta proces denaturacije, žarjenja in raztezka se ponovi večkrat (30-40) krat, s čimer se eksponentno povečuje število kopij želenega gena v zmesi. Čeprav bi bil ta postopek precej dolgočasen, če bi ga lahko izvajali ročno, lahko vzorce pripravimo in inkubiramo v programabilnem Thermocyclerju, ki je sedaj v večini molekularnih laboratorijev, in celotno PCR reakcijo lahko izvedemo v 3-4 urah.
Vsak denaturni korak ustavi postopek raztezanja prejšnjega cikla, s čimer skrajša novo vrsto DNK in ohranja približno približno velikost želenega gena.
Trajanje cikla raztezanja je lahko daljše ali krajše, odvisno od velikosti zanimanja, vendar se s ponavljajočimi se ciklusi PCR večina vzorcev omeji na velikost samega gena, saj bodo proizvedeni iz produktov obeh pragov.
Za uspešno PCR je več dejavnikov, ki jih je mogoče manipulirati, da bi izboljšali rezultate. Najbolj razširjena metoda za testiranje prisotnosti produkta PCR je elektroforeza agaroznega gela . Ki se uporablja za ločevanje fragmentov DNK glede na velikost in napolnjenost. Drobci se nato vizualizirajo z barvili ali radioizotopi.
Evolucija
Od odkritja PCR so odkrili DNA polimeraze, ki niso originalni Taq. Nekateri od njih imajo boljšo sposobnost "lektoriranja" ali so bolj stabilni pri višjih temperaturah, s čimer se izboljša specifičnost PCR in zmanjša napake pri vstavljanju napačnega dNTP.
Nekatere variante PCR so bile zasnovane za specifične aplikacije in se zdaj redno uporabljajo v molekularnih genetskih laboratorijih. Nekateri od teh so PCR v realnem času in PCR z reverzno transkriptazo. Razkritje PCR je pripeljalo tudi do razvoja zaporedja DNK , DNA prstnih odtisov in drugih molekularnih tehnik.