Prilagoditve k katerimkoli komponentam reakcije verižne reakcije s polimerazo (PCR) lahko spremenijo kakovost rezultata tako, da izboljšajo ali zmanjšajo donos in kakovost proizvoda ali izboljšajo specifično odzivnost in občutljivost. Parametri, ki vplivajo na končni rezultat, so lahko fizični (tj. Temperatura, čas cikla) ali kemični (tj. Koncentracija vzorca, vrsta uporabljenega encima). V nadaljevanju je nekaj ključnih dejavnikov, ki vplivajo na uspeh PCR.
01 Čisti laboratorijski pogoji
Ker je PCR zmožen zaznati eno molekulo DNK, je pomembno, da v laboratoriju ohranimo neokrnjene razmere. Vedno nosite sveže rokavice, uporabljajte sterilno steklovino, cevi in pipete ter sterilne raztopine in očistite delovno področje pred začetkom dela.
Vedno vključite kontrolne reakcije, brez vzorčne DNA in brez encima, da zagotovite, da so rezultati resnično posledica ojačitve pravega vzorca.
Večina ljudi poskrbi za lasten nabor rešitev, ki jih ne delijo, da bi lažje odpravljali težave, in določeni pipeti so pogosto namenjeni samo za PCR. Tudi PCR cevi, ki ne vsebujejo DNaze in RNase, odporni na aerosolne pipete in delajo v dima s UV svetlobo, so tudi načini za zmanjšanje težav.
02 Kemične komponente
- Imate 18 do 24 baz
- Nimajo sekundarne strukture (npr. Zankaste zanke)
- Imeti uravnoteženo porazdelitev G / C in A / T parov
- Se ne dopolnjujejo med seboj na koncih s tremi nogami
- Temperature taljenja (Tm) okoli 5-10 stopinj Celzija pod temperaturo žarjenja, ki je običajno med 55 in 65 stopinj Celzija
Tm za oba primera bi morala biti podobna tudi za najboljše rezultate.
03 Reakcijska mešanica: predlogo in prajmeri
Optimalne koncentracije primerja med 0,1 in 0,6 mikromola / L. Količina predloge se razlikuje glede na vrsto DNA (človeka, bakterije, plazmida).
Z zelo majhnimi količinami predloge obstajajo druge strategije za izboljšanje rezultatov, kot so povečana števila ciklov ali uporaba "vročega zagona". Vedno testirajte nove prašne primere s pozitivnim reakcijskim nadzorom, da se prepričate, da delujejo pod vašimi specifičnimi eksperimentalnimi pogoji.
04 Reakcijska mešanica: encimska aktivnost
Koncentracija MgCl2 v reakcijski mešanici lahko vpliva na rezultat PCR in bi lahko igrala pomembno vlogo pri hitrejših reakcijah. Magnezijev kation tvori topne komplekse z dNTP, da proizvedejo dejanski substrat, ki ga prepozna polimerazni encim.
Enake količine vseh štirih dNTP-ov pomagajo tudi zmanjšati stopnjo napake polimeraze. Nekateri dodatki, kot so betain, BSA, detergenti, DMSO, glicerol in pirofosfataza, lahko vplivajo tudi na encimsko specifičnost ali učinkovitost reakcije.
05 Tip termocikla
Pri nakupovanju za laboratorijsko opremo upoštevajte, da so nekateri termocikli manj natančni kot drugi pri vzdrževanju natančnih, želenih temperatur.
To je eno področje, kjer se poceni ne bo odplačevalo na dolgi rok, ko se boste soočili s finičnimi reakcijami ali z uporabo pragov, ki zahtevajo ozek obseg temperature.
Reševalne cevi s tankimi stenami, ki so prilagojene natančni znamki termociklov, ki jih uporabljate, prav tako pomagajo optimirati reakcijske temperature.
06 Nastavitve cikla
Povečana donosnost je mogoče doseči s povečanjem časa podaljšanja za vsakih 20 ciklov, tako da kompenzira manj encimov, da bi povečali večjo šablono. Običajno je manj kot 40 ciklov dovolj, da pomnoži manj kot 10 vzorčnih molekul na koncentracijo, ki je dovolj velika, da si ogledate agarozni gel, obarvani z etidijevim bromidom.