Stopnja čiste potrebe po proteini je odvisna od predvidene končne uporabe proteina.
Za nekatere aplikacije je dovolj surovega izvlečka. Za druge uporabe, na primer v živilih in farmacevtskih izdelkih, pa je potrebna visoka raven čistosti. Da bi to dosegli, se običajno uporabljajo številne metode čiščenja proteinov, v več korakih čiščenja.
Vsak korak čiščenja beljakovin običajno povzroči določeno stopnjo izgube izdelka. Zato je idealna strategija čiščenja proteinov tista, v kateri je dosežena najvišja stopnja čiščenja v najmanjših korakih. Izbira teh korakov za uporabo je odvisna od velikosti, polnjenja, topnosti in drugih lastnosti ciljnega proteina. Naslednje tehnike so najbolj primerne za čiščenje posameznega citosolnega proteina. Čiščenje kompleksov citosolnih proteinov je bolj zapleteno in običajno zahteva uporabo različnih metod.
Prvi koraki za čiščenje proteinov
Prvi korak pri čiščenju intraceličnih proteinov v notranjosti celice je priprava surovega ekstrakta .
Ekstrakt bo vseboval kompleksno mešanico vseh proteinov iz celične citoplazme in nekatere dodatne makromolekule, kofaktorje in hranila. Surovi ekstrakt se lahko uporablja za nekatere aplikacije v biotehnologiji, vendar če je čistost problem, je treba upoštevati nadaljnje korake čiščenja.
Surove beljakovinske ekstrakte pripravimo z odstranjevanjem celičnih ostankov, ki nastanejo s celično lizo, kar dosežemo z uporabo kemikalij in encimov , sonifikacije ali francoskega tiska. Ostanke odstranimo s centrifugiranjem, supernatant pa se regenerira. Surove pripravke zunajceličnih beljakovin lahko dobimo z enostavnim odstranjevanjem celic s centrifugiranjem.
Za nekatere biotehnološke aplikacije obstaja povpraševanje po termostabilnih encimih : encimov, ki lahko prenašajo visoke temperature brez denaturiranja in hkrati ohranjajo visoko specifično aktivnost. Organizmi, ki jih proizvajajo, se včasih imenujejo ekstremofili. Enostaven pristop k čiščenju toplotno odpornega proteina je denaturiranje drugih proteinov v mešanici s segrevanjem, nato pa hlajenje raztopine (s čimer se dovoli, da se termostabilni encim preoblikuje ali ponovno raztopi, denaturirane beljakovine pa jih lahko nato odstranimo s centrifugiranjem.
Vmesni koraki čiščenja
V preteklosti je bil skupen drugi korak za čiščenje beljakovin iz surovega ekstrakta z obarjanjem v raztopini z visoko osmotsko močjo (npr. Raztopine soli). Nukleinske kisline v surovem ekstraktu lahko odstranimo s precipitacijskimi agregati, ki jih tvorijo streptomicin sulfat ali protamin sulfat.
Obarjanje beljakovin običajno poteka z uporabo amonijevega sulfata kot soli.
Različne beljakovine se bodo obarale v različnih koncentracijah amonijevega sulfata . Na splošno proteini z višjo molekulsko maso precipitirajo v nižjih koncentracijah amonijevega sulfata. Padavine soli običajno ne vodijo do zelo očiščenega proteina, ampak lahko pomagajo pri odpravljanju nekaterih neželenih beljakovin v zmesi in koncentriranju vzorca. Soli v raztopini nato odstranimo z dializo skozi porozno celulozno cevko, filtracijo ali gelsko izključno kromatografijo.
Sodobni biotehnološki protokoli pogosto izkoriščajo številne komercialno na voljo komplete, ki zagotavljajo pripravljene rešitve za standardne postopke. Čiščenje proteinov se pogosto izvaja s filtri in pripravljenimi gelnimi filtrirnimi stebri. Vse, kar morate storiti, je, da sledite navodilom in dodate pravi volumen pravilne rešitve in počakate na določeno časovno obdobje med zbiranjem eluenta (kar pride na drugi konec stolpca) v sveži epruveti.
- Kromatografske metode je mogoče uporabiti z uporabo stolpcev na vrhu ali avtomatizirane HPLC opreme. Ločitev s HPLC se lahko opravi z metodami reverzne faze, izmenjave ionov ali velikosti in vzorci, ki jih zaznajo diode ali laserska tehnologija. -
Vizualizacija beljakovin in ocena čiščenja
- Kromatografija z reverzno fazo (RPC) ločuje beljakovine na podlagi njihove relativne hidrofobnosti . Ta tehnika je zelo selektivna, vendar zahteva uporabo organskih topil. Nekateri proteini trajno denaturirajo topila in bodo med RPC izgubili funkcionalnost. Zato ta metoda ni priporočljiva za vse aplikacije, zlasti če je ciljna beljakovina potrebna za ohranitev aktivnosti.
- Jonska izmenjevalna kromatografija se nanaša na ločevanje proteinov na osnovi polnjenja . Stolpci so lahko pripravljeni za izmenjavo anionov ali izmenjavo kationov. Anionski izmenjalni stolpi vsebujejo stacionarno fazo s pozitivnim nabojom, ki privlači negativno napolnjene proteine. Kationski izmenjalni stolpi so obrnjeni, negativno nabiti kroglice, ki pritegnejo pozitivno nabite proteine. Eluiranje ciljnih beljakovin se izvaja s spremembo pH v koloni, kar povzroči spremembo ali nevtralizacijo zaračunanih funkcionalnih skupin vsakega proteina.
- Velikostno-izključitvena kromatografija ( gelna filtracija ) ločuje večje beljakovine od majhnih, saj večje molekule potujejo hitreje prek navzkrižno vezanega polimera v kromatografski koloni. Velike beljakovine ne spadajo v pore polimerov, medtem ko manjše beljakovine počnejo in trajajo dlje, da potujejo skozi kromatografsko kolono preko manj neposredne poti. Eluat se zbira v seriji cevi, ki ločujejo beljakovine na podlagi elucijskega časa. Gelna filtracija je uporabno orodje za koncentriranje vzorca beljakovin, ker se ciljni protein zbira v manjšem volumnu eluiranja, kot je bil prvotno dodan v kolono. Podobne tehnike filtriranja se lahko uporabljajo pri obsežni proizvodnji beljakovin zaradi njihove stroškovne učinkovitosti.
- Affinity kromatografija je zelo uporabna tehnika za "poliranje" ali dokončanje procesa čiščenja beljakovin. Kroglice v kromatografski koloni so prečno povezane z ligandi, ki se specifično vežejo na ciljni protein. Protein nato odstranimo iz kolone z izpiranjem z raztopino, ki vsebuje proste ligande. Ta metoda daje najčiste rezultate in najvišjo specifično aktivnost v primerjavi z drugimi tehnikami.
- SDS-PAGE je elektroforeza poliakrilamidnega gela, izvedena v prisotnosti SDS (natrijev dodecil sulfat), ki se veže na beljakovine, ki jim dajejo veliko neto negativno energijo. Ker so cene vseh proteinov precej enake, jih ta metoda skoraj popolnoma ločuje glede na velikost. SDS-PAGE se pogosto uporablja za testiranje čistosti beljakovin po vsakem koraku v seriji. Ker se neželeni proteini postopoma odstranijo iz mešanice, se zmanjša število pasov, vizualiziranih na gelu SDS-PAGE, dokler ni le en pas, ki predstavlja želeni protein.
- Imunoblotting je tehnika vizualizacije proteinov, ki se uporablja v kombinaciji s kromatografijo na afiniteto. Protitelesa za specifično beljakovino uporabljamo kot ligande na koloni afinitetne kromatografije. Ciljni protein se ohrani na koloni, nato pa ga odstranimo s spiranjem kolone s solno raztopino ali drugimi sredstvi. Protitelesa, vezana na radioaktivne ali barvne nalepke, pomagajo pri odkrivanju ciljne beljakovine, ko je ločena od preostale mešanice.
Viri:
Zubay G. 1988. Biokemija, 2. izdaja. Macmillan Publishing Co., New York, NY, ZDA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Priročnik za čiščenje proteinov, izdaja AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc., New Jersey, ZDA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.