Zaporedje DNK je odvisno tudi od naše sposobnosti uporabe gelske elektroforeze, da ločimo pramene DNA, ki se razlikujejo po velikosti za en par baznih parov.
Sequencing DNA
V poznih sedemdesetih letih smo izumili dve tehniki zaporedja DNA za daljše DNA molekule. To sta bila metoda Sanger (ali dideoxy) in metoda Maxam-Gilbert (kemijska cepitev). Metoda Maxam-Gilbert temelji na cepitvi s specifičnimi nukleotidi s kemikalijami in se najbolje uporablja za sekvenciranje oligonukleotidov (kratki nukleotidni polimeri, običajno manjši od 50 baznih parov v dolžini). Metoda Sanger se pogosteje uporablja, ker se je izkazalo, da je tehnično lažje uporabljati, in s pojavom PCR-jev in avtomatizacije tehnike se enostavno uporablja za dolge strune DNK, vključno z nekaterimi celotnimi geni. Ta tehnika temelji na končanju verige s pomočjo dideoxinukleotidov med reakcijami raztezanja PCR.
Metoda Sangerja
V Sangerjevi metodi se DNA analiza uporablja kot matrica in se v PCR reakciji uporablja DNA-polimeraza, da se ustvarjajo brezplačne pramene z uporabo pragov.
Pripravijo se štiri različne reakcijske mešanice PCR, od katerih vsaka vsebuje določen odstotek analogov dideoxinukleozid trifosfata (ddNTP) enemu od štirih nukleotidov (ATP, CTP, GTP ali TTP). Sinteza novega DNA droga se nadaljuje, dokler ni vključen eden od teh analogov, pri čemer je trak predčasno skrajšan.
Vsaka PCR reakcija bo na koncu vsebovala mešanico različnih dolžin DNA pramenov, vse se konča z nukleotidom, ki je bil za to reakcijo označen dideoxy. Gelsko elektroforezo nato uporabimo, da ločimo pramene štirih reakcij v štirih ločenih stezah in določimo zaporedje prvotne predloge, ki temelji na tem, katere dolžine pramenov končajo s tem, kateri nukleotidi.
V avtomatski reakciji Sanger se uporabljajo primerji, ki so označeni s štirimi različnimi barvnimi fluorescentnimi oznakami. PCR reakcije v prisotnosti različnih dideoxy nukleotidov izvajamo, kot je opisano zgoraj. Naslednje pa se štiri reakcijske mešanice nato kombinirajo in nanesejo na eno vrsto gela. Barva vsakega fragmenta je zaznana z laserskim žarkom in informacije zbira računalnik, ki ustvarja kromatograme, ki prikazujejo vrhove za vsako barvo, iz katere je mogoče določiti zaporedje sekvenc DNA.
Običajno je avtomatizirana metoda zaporedja natančna samo za zaporedje do največ 700-800 baznih parov v dolžini. Vendar pa je mogoče pridobiti polno zaporedje večjih genov in v resnici celotne genome, ki uporabljajo postopke po korakih, kot je primerjanje Walking in Shotgun sequencing.
V Primeri hoje se delovni del večjega gena sekvencira z uporabo metode Sanger. Novi primerji so ustvarjeni iz zanesljivega segmenta zaporedja in se uporabljajo za nadaljevanje zaporedja dela gena, ki je izven dosega prvotnih reakcij.
Zaporedje s puškami pomeni naključno zmanjšanje interesa segmenta DNA v primernejših (obvladljivih) velikostnih delcih, zaporedje vsakega fragmenta in urejanje kosov na podlagi prekrivajočih sekvenc. Ta tehnika je olajšala uporaba računalniške programske opreme za urejanje prekrivajočih se delov.